El objetivo principal para la identificación de especies fúngicas es la región espaciadora transcrita interna (ITS). En el diagnóstico molecular, la región ITS del ADN ribosómico, específicamente las subregiones ITS1 e ITS2, es el estándar de oro para tipificar e identificar mohos y aislados fúngicos. Esta región ofrece un equilibrio óptimo entre secuencias flanqueantes altamente conservadas, que permiten la amplificación universal mediante PCR en diversas especies de hongos, y secuencias internas hipervariables que proporcionan poder discriminatorio a nivel de especie.
Para la identificación molecular de amplio espectro de hongos, la región ITS (ITS1 e ITS2) es el código de barras primario establecido. Sus sitios universales de unión de cebadores y su alta variabilidad interespecífica la convierten en el objetivo único más fiable para el diagnóstico clínico, aunque los dominios D1/D2 del gen ARNr 28S constituyen una valiosa opción secundaria cuando la resolución de ITS es insuficiente.
Fundamento biológico: por qué ITS es el código de barras universal de los hongos
El predominio de la secuenciación de ITS en micología no es accidental. Se deriva directamente de la arquitectura evolutiva única del grupo de genes del ARN ribosómico (ARNr) y de cómo este equilibra la conservación con la variabilidad.
Estructura del operón de ARNr fúngico y ubicación de ITS1/ITS2
El operón de ARNr de los hongos consta de los genes 18S (subunidad pequeña), 5.8S y 28S (subunidad grande), separados por dos espaciadores transcritos internos: ITS1 (entre 18S y 5.8S) e ITS2 (entre 5.8S y 28S).
Los genes de ARNr flanqueantes están altamente conservados en todos los hongos, lo que proporciona sitios de anclaje ideales para los cebadores universales de PCR. Esto permite que un único conjunto de cebadores amplifique la región ITS a partir de prácticamente cualquier aislado fúngico, incluidas levaduras, mohos y hongos dimórficos.
La alta variabilidad interespecífica permite la resolución a nivel de especie
Mientras que los genes de ARNr flanqueantes están restringidos evolutivamente, los propios espaciadores ITS están sometidos a una presión selectiva mucho menor. Esto da lugar a una divergencia sustancial de la secuencia entre especies, pero a una uniformidad relativa dentro de una misma especie.
En particular, ITS2 suele presentar suficiente variación para distinguir especies estrechamente relacionadas. Esta alta variabilidad es la que confiere a ITS su poder discriminatorio, permitiendo que el diagnóstico molecular identifique patógenos fúngicos exigentes, atípicos o morfológicamente indistinguibles que dificultan los métodos convencionales.
Las alternativas y cuándo utilizarlas
Aunque ITS es el objetivo principal, no es el único. La referencia complementaria señala correctamente los dominios D1/D2 del gen ARNr 28S como otra opción validada, y comprender esta alternativa es fundamental para diseñar ensayos sólidos.
D1/D2 del gen ARNr 28S como objetivo complementario
El gen de ARNr de la subunidad grande contiene dominios hipervariables, de los cuales D1 y D2 son los más informativos para la identificación de especies.
Estas regiones son menos variables que ITS y, por lo tanto, a menudo no logran resolver especies muy estrechamente relacionadas. Sin embargo, proporcionan una señal filogenética más estable y son menos propensas a algunas de las complicaciones intragenómicas que pueden afectar a ITS. Se utilizan con frecuencia como objetivo de confirmación secundaria o cuando falla la amplificación de ITS.
Diseño diagnóstico: elección entre ITS y 28S
Para un panel de identificación fúngica de amplio espectro, ITS debe ser su primera opción. Los cebadores universales dirigidos a las secuencias conservadas de 18S y 28S o 5.8S amplifican de forma fiable ITS1, ITS2 o la región completa ITS1-5.8S-ITS2.
Utilice la región D1/D2 de 28S cuando necesite una asignación taxonómica de nivel superior (por ejemplo, cuando una especie sea nueva y no esté incluida en la base de datos de ITS) o cuando encuentre géneros específicos como los complejos de especies de Aspergillus, en los que ITS por sí sola puede no proporcionar una resolución definitiva. Los ensayos validados más sólidos suelen combinar la secuenciación de ITS y D1/D2 para maximizar las tasas de identificación y la confianza.
Implementación del diagnóstico basado en ITS: consideraciones clave
Pasar de la teoría a un ensayo diagnóstico sólido requiere no solo seleccionar el objetivo adecuado, sino también gestionar los desafíos prácticos del ADN fúngico.
Diseño de cebadores anclado en regiones conservadas
Una PCR de amplio espectro eficaz depende de cebadores que se unan a secuencias comunes a todos los hongos. Los pares de cebadores estándar se dirigen al ADNr 18S (para ITS1) y al ADNr 28S (para ITS2), o al gen 5.8S conservado (para la amplificación de ITS2).
El objetivo es amplificar un producto lo bastante largo como para contener información a nivel de especie, pero lo bastante corto como para permitir una PCR eficiente, normalmente de 200–600 pb. En muestras clínicas directas con una baja carga fúngica, se pueden añadir a estos amplicones sondas internas específicas de especie para PCR cuantitativa en tiempo real, con el fin de lograr una detección sensible y multiplexada.
Control de la contaminación de reactivos con enzimas libres de ADN fúngico
Un problema crítico y a menudo pasado por alto es la presencia de ADN fúngico de fondo en enzimas recombinantes producidas comercialmente, como la polimerasa Taq. Debido a que estas enzimas se producen en levaduras u otros huéspedes fúngicos, los ácidos nucleicos residuales pueden contaminar la mezcla maestra.
En una PCR panfúngica que amplifica objetivos fúngicos universales, esta contaminación produce señales falsamente positivas. Los desarrolladores de productos IVD deben obtener polimerasas libres de ADN fúngico y materiales de control positivo/interno validados para mantener la especificidad y sensibilidad analíticas sin reactividad cruzada.
Comprensión de las ventajas y limitaciones
Ningún objetivo molecular es perfecto. La confianza se construye reconociendo las limitaciones de ITS incluso cuando se defiende su utilidad.
Limitaciones de ITS para determinados taxones
Algunos grupos de hongos presentan una baja variabilidad interespecífica de ITS que impide una separación fiable a nivel de especie. Los ejemplos clínicamente más relevantes se encuentran en las secciones Fumigati y Nigri de Aspergillus, así como en algunos complejos de especies de Fusarium.
En estos casos, ITS puede resolver únicamente hasta el nivel de complejo o sección. A menudo se requiere un objetivo secundario, como los genes de la β-tubulina, la calmodulina o el factor de elongación de la traducción 1-α, para lograr una identificación definitiva. La región D1/D2 también puede ser útil, aunque puede presentar la misma limitación.
Heterogeneidad intragenómica y variación en el número de copias
La mayoría de los hongos contiene cientos de copias del operón de ARNr. Estas copias no siempre son idénticas; existe variación de secuencia intragenómica, lo que puede provocar llamadas de bases ambiguas durante la secuenciación directa y sugerir falsamente una infección mixta.
El número de copias también varía ampliamente entre especies e incluso según las condiciones de crecimiento, lo que afecta directamente a la sensibilidad de los diagnósticos basados en PCR. Un objetivo con un alto número de copias, como el clúster de ARNr multicopia, aumenta la sensibilidad analítica, pero también amplifica el riesgo de detectar variantes de secuencia que no representan el consenso real de la especie.
Cómo elegir correctamente según el objetivo diagnóstico
La selección del objetivo debe estar impulsada por el problema clínico específico que se desea resolver. Este es el enfoque recomendado:
- Si su objetivo principal es la identificación de amplio espectro a nivel de especie de mohos desconocidos en un flujo de trabajo independiente del cultivo: Comience con la región ITS completa (ITS1-5.8S-ITS2), secuenciada mediante NGS o Sanger. Combínela con un ensayo D1/D2 de confirmación para obtener informes de alta confianza.
- Si su objetivo principal es una PCR cuantitativa en tiempo real dirigida a un género específico como Aspergillus o Pneumocystis directamente a partir de muestras clínicas: Utilice la región ITS2, pero valide las sondas específicas de especie frente a especies estrechamente relacionadas para garantizar la exclusividad del ensayo. Añada objetivos génicos secundarios si la resolución clínica requiere distinguir especies crípticas dentro de un complejo.
- Si su objetivo principal es la asignación filogenética o se encuentra con una muestra en la que ITS no produce una especie clara: Confíe en el dominio D1/D2 de 28S como un código de barras robusto y altamente amplificable que, combinado con genes codificantes de proteínas, sitúa el aislado dentro de un marco taxonómico fiable.
Al seleccionar la región de secuencia adecuada para la pregunta diagnóstica correcta, utilizando ITS como perspectiva principal, desarrollará ensayos robustos y clínicamente accionables.
Tabla resumen:
| Región objetivo | Aplicación diagnóstica principal | Ventajas clave | Limitaciones clave |
|---|---|---|---|
| Región ITS (ITS1 e ITS2) | Código de barras primario de referencia para la identificación de especies de amplio espectro | Máxima variabilidad interespecífica; sitios universales de unión de cebadores | Resolución limitada en complejos crípticos (por ejemplo, Aspergillus) |
| ARNr 28S (dominio D1/D2) | Objetivo secundario/complementario; asignación taxonómica amplia | Señal filogenética estable; amplificación fiable | Menor divergencia de secuencia entre especies estrechamente relacionadas |
| Genes secundarios (β-tubulina, TEF-1α) | Tipificación de alta resolución para complejos/secciones específicos | Resuelve especies dentro de complejos difíciles (Fusarium, Aspergillus) | Requiere cebadores específicos del género; cobertura de base de datos menos universal |
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