Anticuerpo monoclonal de conejo anti-Cas9 para WB, IF/ICC y ELISA - Q99ZW2

Especificaciones y parámetros principales del producto

Antecedentes biológicos: función y localización de Cas9

• Cas9 (endonucleasa Cas9/Csn1 asociada a CRISPR) es una endonucleasa de ADN guiada por ARN de 158,4 kDa que constituye el núcleo enzimático del sistema inmunitario adaptativo CRISPR-Cas de tipo II en Streptococcus pyogenes. Referencias relacionadas: PMID:21455174
• En su función biológica natural, Cas9 protege a las bacterias frente a plásmidos invasores y ADN vírico mediante la incorporación de secuencias foráneas cortas (espaciadores) en los loci CRISPR, proporcionando una memoria genética para la inmunidad específica de secuencia. Referencias relacionadas: PMID:21455174
• Cas9 requiere dos ARN pequeños —un ARN CRISPR (crRNA) y un crRNA transactivador (tracrRNA)— tanto para la unión al ADN diana como para la actividad nucleasa; es catalíticamente inactiva en ausencia de estos ARN guía. Referencias relacionadas: PMID:24270795 PMID:24476820
• El reconocimiento de la diana está regulado por un motivo adyacente al protoespaciador corto (PAM; 5'-NGG-3') dentro de la repetición CRISPR, que sirve para discriminar el ADN propio del no propio; la unión al PAM inicia la separación de las hebras de ADN y la formación de un heterodúplex. Referencias relacionadas: PMID:24476820
• Tras el reconocimiento del PAM, Cas9 cataliza la escisión endonucleolítica de la hebra diana no complementaria al crRNA, seguida de un recorte exonucleolítico de 3'-5'; ambos pasos nucleasa dependen de iones de magnesio o manganeso. Referencias relacionadas: PMID:24476820
• Durante la maduración del ARN CRISPR, Cas9 no cataliza el procesamiento; estabiliza el dúplex pre-crRNA:tracrRNA, permitiendo su escisión precisa por la ribonucleasa III del huésped. Referencias relacionadas: PMID:24270795

Orientación experimental y consejos técnicos

• El inmunógeno abarca los aminoácidos 450-730 de Cas9, una región que incluye el dominio nucleasa HNH y el dominio de interacción con el PAM. Para el western blot, considere utilizar lisados de células transfectadas con Cas9 o Cas9 recombinante de longitud completa purificada como control positivo; el peso molecular previsto es de 158 kDa.
• En inmunofluorescencia/ICC, la localización de Cas9 puede variar según el ARN guía y la diana. Valide las condiciones de fijación y permeabilización con controles adecuados y confirme la especificidad utilizando líneas celulares con Cas9 inactivada o con Cas9 silenciada, si están disponibles.
• Para ELISA, el fragmento recombinante de Cas9 puede utilizarse para establecer una curva estándar; sin embargo, evalúe la reactividad cruzada con Cas9 endógena u otros miembros de la familia en la matriz biológica correspondiente antes de su aplicación cuantitativa.
• Se prevé que este anticuerpo presente una amplia reactividad cruzada, incluida la reactividad con Cas9 humana. Al utilizar muestras de otras especies, se recomienda realizar una validación inicial para confirmar la reactividad esperada.

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